[DVM]

جلوگیری از تقلبات قصابی ها با استفاده از تكنیك تعیین جنسیت لاشه گاو با استفاده از PCR

چكیده:
از جمله عمده ترین مسائل جهانی در ارتباط با بازاریابی، فروش و صادرات گوشت، همانا كیفیت گوشت تولیدی و مطابق با ذائقه های مختلف مصرف كننندگان می باشد. در قرن اخیر، صنعت پرورش و تولید حیوانات گوشتی به سوی تولید گوشت بدون چربی، تولید بیشتر و نتیجناً افزایش گوشتهای مطبوع و حاوی تردی كافی حركت می كند. گوشت حیوان نر از ارزش اقتصادی بالاتری نسبت به حیوان ماده برخوردار است چرا كه حیوانات ماده عمدتا به منظور تولید مثل نگهداری می شود و طبیعاً ذبح آنها زمانی صورت می پذیرد كه به سن پیری رسیده باشند. موضوع پژوهش زیر استفاده از تكنیك تعیین جنسیت قطعات گوشت عرضه شده در قصابی ها و بررسی صحت و سقم ادعای آن نسبت به فروش گوشت حیوان نر به مشتری می باشد. نمونه های قطعات گوشت از 10 مغازه قصابی در سطح استان (سه نمونه از هر مغازه) به طور تصادفی اخذ گردیده و استخراج DNA به کمک روش Boom (1989) و واكنش زنجیره پلی مراز (PCR) در ابتدا برای تكثیر قطعه ای از ژن لپتین (كنترل) و سپس جهت تكثیر قطعه 307 جفت بازی از ناحیه ای از كروموزوم Y به نام لوكوس BRY1 گاوی انجام گرفت. نتایج حاصل از بررسی نشان داد كه در بیشتر موارد عرضه كنندگان گوشت از صداقت لازم با مشتری برخوردار نبوده و از فروش گوشت حیوان جوان و نر شانه خالی می كنند.
كلمات كلیدی: تعیین جنسیت لاشه، كیفیت گوشت، تقلب در فروش
مقدمه:
از جمله عمده ترین مسائل جهانی در ارتباط با بازاریابی، فروش و صادرات گوشت، همانا كیفیت گوشت تولیدی و مطابق با ذائقه های مختلف مصرف كننندگان، می باشد. در قرن اخیر، صنعت پرورش و تولید حیوانات گوشتی به سوی تولید گوشت بدون چربی، تولید بیشتر و نتیجتاً افزایش گوشتهای مطبوع و حاوی تردی كافی، حركت می كند. امروز توجه به تردی گوشت(Meat tenderness) از مواردی است كه همواره شركتهای تجاری جهانی را در یافتن راهكارهای مناسب در جهت ارتقا كیفیت این پارامتر، به رقابت واداشته است. از مشكلات كنونی در این رابط، فقدان روش طبقه بندی صحیح لاشه، بر اساس تردی نهایی گوشت می باشد. روشهای پیشنهادی اخیر نظیر سیستم طبقه بندی USDA به میزان كافی در پیش بینی تردی گوشت كارآئی ندارند و بنابراین نیاز به روشهایی جدید كه بتواند گوشت را از لحاظ تردی رتبه بندی نمایند، همواره احساس شده است. بكارگیری روشهای ابداعی جدید در كنار روشهای سنتی قبلی و معمول رتبه بندی گوشت، قطعا در بهبود كیفیت و تردی گوشت موثر واقع خواهند گردید. از جمله پارامترهایی كه قبل از ذبح دامهای اهلی، بر تردی و كیفیت گوشت موثر می باشد، می توان به تغدیه، استرس، ژنتیك، جنس، مدیریت اشاره كرد و از جمله فاكتورهایی كه پس از ذبح حیوان با تردی و كیفیت گوشت نهایی مرتبط هستند، می توان زمان پیری پس از جمود نعشی، تحریك پذیری الكتریكی ماهیچه، pH ، لرزش ماهیچه در موقع ذبح، مقدار رگ وپی، دفعات انجماد و ذوب گوشت و بالاخره روشهای پخت گوشت را نام برد. در تهیه خوراك كباب كه مطلوب ذائقه هر ایرانی است كیفیت گوشت خریداری شده از اهمیت عمده ای برخوردار است. معمولا گوشت دام نر از ارزش اقتصادی بالاتری نسبت به دام ماده برخوردار است چرا كه دام ماده به منظور تولید مثل پرورش داده می شود و طبیعتا ذبح آن در 7 الی 8 سالگی صورت می پذیرد یعنی زمانی كه ضخامت فیبرهای ماهیچه ای افزایش یافته و سطح كلاژن بالایی را برخورد دار می باشد. موضوع مطالعه فوق استفاده از تكنیك ساده برای تعیین جنسیت قطعات گوشت عرضه شده در قصابیها و ارزیابی صحت و سقم فروشنده مبنی بر نر جنس حیوان ذبح شده می باشد.
مواد و روشها:
نمونه گیری
تعداد 30 قطعه گوشت متعلق به ده مغازه عرضه گوشت در سطح استان بطور تصادفی انتخاب و اقدام به بیوپسی گردید. نمونه ها در فلاسك حاوی یخ در همان روز به آزمایشگاه انتقال داده شد و كاملا و به طور مجزا چرخ گردید و سپس با استفاده از ازت مایع پودر شد و 200 میلی گرم از هر نمونه توزین و به داخل تیوپ اپندروف منتقل و پس از شمارگذاری آماده استخراج شد.
استخراج DNA: استخراج DNA از نمونه ها با استفاده از روشBoom و همکاران (1989) با استفاده از کیت Diatom انجام گرفت. این روش مبتنی براستفاده از ماده لیز کننده گوانیدین تیوسیانات و جذب کننده سیلیکاژل می باشد. بدین منظور ابتدا 200 میکرولیتر از خون برداشته سپس 500 میكرولیتر بافر هضم كننده (M5 گوانیدین تیوسیانات،mM 20EDTA،mM40 Tris،40 گرم TritonX100، 10 گرم DTT ) به نمونه اضافه شده، نمونه ها به مدت 5 دقیقه در بن ما ری حاوی 65 درجه سانتیگراد انکوبه گردیدند. سپس 20 میكرولیتر محلول نوكلئاز (4 گرم ذرات سیلیكا،100 میكرولیترگوانیدین) اضافه شد و به مدت 10 دقیقه به آرامی ورتكس گردید. سپس به محیط همگن شده، 400 میكرو لیتر بافرسالین( EDTA 20mM , Tris-HCl 10mM , KCl 1M , NaCl 1M )اضافه و در نهایت از طریق ماده Extra Gene (10% رزین 02/0 % ماده رنگی OrangG، 01 /0 درصدTriton X 100 )، DNA زرد رنگ از سایر ناخالصیها جدا گردید. جهت تعیین غلظت نمونه های استخراج DNA شده، از روش الکتروفورز مقایسه ای آگارز با استفاده از مقادیر مشخصی DNA فاژ لامبدا و الکتروفورز استفاده گردید.
انتخاب آغازگرها: آغازگرهای این مقاله توسط از تحقیق Matthew و همكاران (1990) انتخاب و آغازگرها دوجفت27 نوکلئوتیدی بودند كه قطعه ای بطول 307 جفت باز از ناحیه Male specific region به نام لوكوس BRY1 گاوی را تكثیر می نمایند. این قطعه در فرد گاو نر قابل تكثیر و در فرد ماده وجود ندارد.
Forward primer:
-GGATCCGAGAGACACAGAACAGGCTGC
Reverse primer
- TGATCAAGCTAATCCATCCATCCTAT
واكنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR)
انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز به کمک کیت لیوفیلزه PCR Universal (Iso Gene–Moscow) که حاوی Mix، PCR Diluent و Mineral Oil بود بروش استاندارد انجام گرفت. غلظت نهایی مواد در 25 میکرولیتر عبارت بودند از: یک واحد آنزیم Taq Polymerase، 200 میکرومول از هر dNTP، 200 میلی مول MgCl2 ، 20-10 پیکامول مخلوط پرایمرها، 100-50 نانوگرم DNA و بافر استاندارد. واکنش PCR با برنامه حرارتی زیر به تعداد 35 سیکل در دستگاه ترموسایکلر (UNIOII) انجام شد. برنامه حرارتی عبارت بود از: 90 درجه سانتیگراد جهت واسرشته شدن DNA بمدت 60 ثانیه، دمای 58 درجه سانتیگراد جهت اتصال پرایمرها بمدت 30 ثانیه و دمای 72 درجه سانتیگراد جهت سنتز بمدت 1 دقیقه.
الكتروفورز:
جهت مشاهده محصولات PCR از ژل آگارز 8/1 % و ولتاژ 100-70 ولت بمدت 2 ساعت استفاده شد. رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید (mg/ml 10) انجام گرفت. قطعه تکثیر شده زیر لامپ UV با طول موج 230 نانومتر مشاهده و عکسبرداری توسط دستگاه مدل Biometra صورت گرفت.
نتایج:
استفاده از روش Boom و همکاران(1989) برای استخراج DNA از نمونه گوشت برتری خوبی را در استحصال DNA نشان داد

نتایج آزمایش نشان داد كه در بعضی موارد فروشندگان گوشت از صداقت لازم با مشتریان برخوردار نمی باشند و تقلب در گوشت همیشه از مشكلات خریداران می باشد از كل نمونه های بررسی 35 درصد گوشت نر و بقیه گوشت ماده تشخیص داده شد.


REFERENCES
ENNIS, S.; GALLAGHER, T. F. A PCR-based sex-determination assay in cattle based on the bovine amelogenin locus. Animal Genetics, v. 25, n. 6, p. 425-427, 1994.

FUJISHIRO, A. et al. A fast convenient diagnosis of the bovine freemartin syndrome using polymerase chain reaction. Theriogenology, v. 43, n. 5, p. 883-891, 1995.

ITAGAKI Y. Sexing of bovine embryos with male-specific repetitive DNA by polymerase chain reaction: sexing of bovine embryos and production of calves with predicted sex. Journal of Reproduction Development, v. 39, n.1, p. 65-72, 1993. JAFAR, S. I.; FLINT, A. P. F. Use of polymerase chain reaction for sexing red deer (Cervus elaphus) blastocysts. Animal Biotechnology, v. 6, n. 2, p. 111-116, 1995.

SAMBROOCK, J.; FRITSCH, E. f.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Nova York: Cold Spring Harbor, 1989. v. 1.

SCHLEE, P. et al. Growth hormone and insulin-like growth factor I concentrations in bulls of various growth hormone genotypes. Theoretical and Applied Genetics, v. 88, p. 497-500, 1994.


Prevention of butchers fraud in meat sale by bovine carcass sex determination

Beef from male animals is commercially more valuable than beef from female animals, because females are used for reproduction and are normally slaughtered only when older, when the length and rigidity of muscle fibers is increased and the level of collagen is higher resulting in tougher meat of lower quality and thus lower commercial value. Many meatpacking plants sell cow's meat as male meat, causing damage to various meat producing sectors and to consumers. The objective of the study reported in this paper was to develop a technique that would permit the sexing of boned, packaged and chilled, ready for sale beef. The principle of the technique is the same as used for sexing preimplanted cattle embryos, and depends on the fact that males and females can be differentiated by polymerase chain reaction (PCR) amplification of a male-specific region of chromosome Y using a sexually neutral region as an internal control. The State of East Azarbyjan province with the help of representatives of the butchers' union. The amplified male-specific DNA region was the BRY1 region 1 of 307 bp. Genomic DNA was extracted by the silica gel kit. At the end of the DNA extraction procedure DNA was quantified in a spectrophotometer at 260 and 280 nm and its integrity was determined on 0.8% agarose minigel. The DNA samples were stored at 4oC in 1.5 ml Eppendorf tubes. We analyzed 40 samples identified as belonging to males, 9 of which (30%) presented a discordant result, i.e., they actually belonged to females. This method was a cheap and efficient technique for the determination of cattle sex from the carcass. It is technically simple and rapid, permitting its utilization in the prevention of fraud in the commercialization of beef.
Key words:( meat quality, BRY, PCR,Eeast Azarbyjan)
آرش جوانمرد